雜志名稱：Cell

文獻題目：CD10+GPR77+ Cancer-Associated FibroblastsPromote Cancer Formation and Chemoresistance by Sustaining Cancer Stemness

第一作者：ErweiSong

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作者單位：Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China

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本實驗所用產品：RayBiotech人AAH-CYT-5抗體芯片（80個細胞因子抗體芯片）

實驗樣品：胸腺癌患者腫瘤組織

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研究背景：

腫瘤干細胞（CSCs）是對腫瘤形成和腫瘤耐藥性起到重要作用的細胞群，但未有對其的標記物。腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）是許多惡性腫瘤（如胸腺癌/肺癌等）共有的癌細胞，許多研究表明CAFs在腫瘤形成和惡化過程中對腫瘤干細胞（CSCs）有影響，但由于CAFs有許多不同的亞群，各自分泌不同的細胞因子，無法判斷出是哪一類CAF作用于CSCs。本文旨在探究是哪一類CAFs亞群分泌了哪些蛋白分子影響CSCs，使其對化療藥物產生抗性，促使癌癥發展。

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1 結果

1.1?驗證在胸腺癌和肺癌患者中發現的一種高表達CD10和GPR77的CAF細胞亞群與腫瘤耐藥性和低存活的相關性

? ??為了探究是哪一種CAFs亞群影響腫瘤耐藥性和低存活，收集了578位化療前后的胸腺癌患者的組織樣品，分離出CAF同癌細胞共培養，發現耐藥性癌組織中CAF對癌細胞有影響。采用mRNA芯片檢測mRNA表達量，發現CD10和GPR77基因表達量上調，流式免疫熒光染色，表明CD10和GPR77蛋白在耐藥性腫瘤組織CAF中的表達。

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1.2?驗證CD10+GPR77+CAF誘導癌細胞耐受和自身耐受

????為探究高表達CD10和GPR77的CAF亞群是否通過誘導細胞耐受影響癌細胞，收集CD10+GPR77+ CAF，同抑制藥物處理的癌細胞共培養，發現CD10+GPR77+ CAF有效維持了癌細胞系和原代癌細胞的存活。

????為更明顯的說明誘導效果，注射癌細胞到免疫功能不全的小鼠乳腺中，建立移植瘤小鼠模型。發現CD10+GPR77+ CAF不止自身抵抗化療，還能誘導腫瘤細胞在其CAF微環境影響下耐受。

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1.3?驗證CD10+GPR77+CAF組成CSCs 的Supporting Niche（微環境）

????由于在胸腺癌耐藥性樣本中發現ALDH1+ CSCs的比例升高，進行臨床胸腺癌CSCs和CD10+GPR77 CAF的相關性實驗，在ALDH1+CSCs中發現CD10+GPR77+ CAF，建立派生瘤模型（PDX），進一步探究在移植瘤模型中CD10+GPR77+CAF是否有助于腫瘤形成的能力，發現了胸腺癌基質中的CD10+GPR77+CAFs有助于PDX的建模和通過CSC增殖形成腫瘤的能力。

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1.4?驗證CD10+GPR77+CAFs通過分泌白介6（IL6）和白介素8（IL8）誘導CSCs增殖

? ? ? ??為探究CD10+GPR77+ CAFs的作用機制，使用人類蛋白抗體芯片檢測了CD10+GPR77+CAFs分泌的蛋白因子，通過蛋白板檢測CD10+GPR77+CAFs分泌蛋白，發現了IL-6 和 IL-8蛋白量在CD10+GPR77+CAF明顯增多，說明CD10+GPR77+ CAF通過分泌IL-6 和 IL-8，促進CSC增殖和腫瘤派生轉移，誘導腫瘤耐受性，分別進行沉默IL-8基因和IL6基因，發現CD10+GPR77+CAFs產生IL-8，IL-8依賴于IL6調控。

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1.5?驗證通過P300調控P65乙酰化延遲NF-kB激活，以維持CD10+GPR77+CAFs的表型和功能

? ? ? ??為解釋CD10+GPR77+CAFs持續產生IL6和IL8激活信號通路的機制，進行了富集分析GSEA（gene set enrichment analysis）、WB（Western Blotting）發現在CAFs中，通過p65磷酸化（S536）和乙酰化（K310）維持 NF-kB的活化，同時也需要其他分子信號（如IKK活化）參與。免疫沉淀反應發現p65與p300的相互作用影響其在K310的乙酰化。

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1.6?驗證在CD10+GPR77+CAFs中，GPR77誘導P65磷酸化是p65乙酰化和參與NF-kB活化的前提

? ? ? ??進一步探究CD10和GPR77 蛋白是否在CD10+GPR77+CAFs中參與信號通路和維持細胞功能。敲除GPR77基因，發現IL6和IL8分泌明顯減少，NF-kB活化受到抑制，p65蛋白減少。沉默GPR77完全抑制RSK1的表達，對IKK沒有明顯影響。說明GPR77誘導P65磷酸化是p65乙酰化和參與NF-kB活化的前提。在MCF-7共培養胸腺癌細胞中，沉默GPR77可終止CD10+GPR77+ CAFs促進CSC增殖和耐藥性的能力。由于GPR77是C5a補體的受體，進一步探究CAF自身是否產生維持GPR77信號表達的補體。發現在CD10+GPR77+CAFs產生較多C5a補體。（6J/6K）且NF-kB調控C5a產生。

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1.7?抗GPR77腫瘤抑制劑和提高化療效果治療胸腺癌派生瘤模型