雜志名稱：Cellular and Molecular Life Sciences

文獻題目：Lecompte, Sophie, et al. "Skeletal muscle secretome in Duchenne muscular dystrophy: a pivotal anti-inflammatory role of adiponectin."?Cellular and Molecular Life Sciences?74.13 (2017): 2487-2501.

第一作者：S. Lecompte

作者單位：

Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute?of Experimental and Clinical Research, Catholic University?of Louvain

本實驗所用產品：RayBio人 AAH-CYT-1000抗體芯片（120個細胞因子抗體芯片）

實驗樣品：細胞培養上清

研究背景：

杜氏肌營養不良是一種X染色體隱性遺傳疾病，主要發生于男孩。據統計，全球平均每3500個新生男嬰中就有一人罹患此病。患者在學齡前就會因骨骼肌不斷退化出現肌肉無力或萎縮，導致不便行走。大概在7歲到12歲時，會徹底喪失行走能力，通常到20多歲就會因為心肌、肺肌無力而死亡。針對該病，醫學界尚無有效療法。杜氏肌營養不良，一種危害人們的健康的疾病。肌營養不良蛋白缺陷型肌纖維的收縮會產生嚴重的損傷，并產生肌纖維壞死和再生的循環。這些改變導致慢性炎癥，這是這種疾病的發病機制的關鍵特征。在這種情況下，細胞因子和趨化因子在DMD相關的肌肉炎癥中發揮重要和多樣化的作用。前期研究表明脂聯素（ApN）在骨骼肌上表現出抗炎性質，并減輕mdx小鼠的營養不良表型。在這里，我們研究ApN是否在DMD患者獲得的肌管細胞中保留其抗炎作用。我們通過研究其分泌物和ApN的早期關系來揭開潛在的機制。

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1 分組

細胞培養上清樣本：

DMD組成肌細胞上清（n=4）

對照組成肌細胞上清（n=3）

2 結果

2.1??DMD組及對照組肌小管細胞鑒定

成肌細胞分化為肌管在對照（C）和DMD細胞之間沒有差異，如分化開始后第0,3和11天（即分化前后，中期和晚期階段）。更具體地說，在第11天，成熟肌管在兩組中表現出相同的特征性。同樣，在分化過程中，在C和DMD細胞中，肌原性標記的基因表達也相似地增加。

2.2?DMD組及對照組自身的脂聯素表達

我們檢測了基礎狀態下ApN的生產。與對照組相比，營養不良肌管的ApN mRNA和蛋白表達分別下降約60％?15％。?這暗示了DMD肌管中ApN的潛在缺陷，并支持推薦肌營養不良中ApN補充的理論。

2.3?脂聯素在人類對照和DMD肌管中的抗炎特性

隨后對ApN治療是否在營養不良肌肉中保持其抗炎特性進行研究。為了模擬DMD的炎癥微環境，通過炎癥因子（TNFα/IFNγ）對肌管進行了刺激，TNFα在惡化疾病中起著關鍵的致病作用。在C肌管中，TNFα與INFγ結合誘導其自身的基因表達，IL-6的表達被認為是抵抗炎癥狀態的表現。伴隨的ApN治療，TNFα基因表達的下調（?-30％），進一步上調IL-6（?+ 75％）的表達。ApN實際上下調了TNFα mRNA（?-25％），同時進一步上調IL-6mRNA（?+ 20％）。 這些數據表明ApN可能在營養不良的肌肉中保留其抗炎特性。

2.4?抗體芯片篩選ApN作用下細胞上清中的差異因子

篩選來自DMD肌管的培養基在或不存在ApN處理的情況下炎癥刺激所引起的變化。在測試的120個細胞因子中，64個由肌管分泌。在ApN存在的情況下，10種蛋白分泌有差異：8種細胞因子低分泌，而另外兩種則分泌過量。這些肌肉蛋白屬于五個家族：促炎因子和抗炎因子/細胞因子，生長因子，可溶性受體和趨化因子。接下來用ELISA定量這些差異因子進行驗證。結果表明，通過ApN處理下調兩種促炎因子（TNFα和IL-17A），一種可溶性受體（sTNFRII）和一種趨化因子（CCL28）的分泌。相反，只有IL-6上調，其可能具有抗炎特性。

2.5 ?ApN在對照組和DMD肌管中的抗炎作用的機制

接下來研究連接AdipoR1-SIRT1-PGC-1α的信號通路是否參與了DMD肌管中ApN的抗炎作用。為此，使用特異性siRNA敲除了該途徑的每個組分。首先證實，siRNA沉默是有效的，如靶基因表達的顯著降低（-65至-95％）。接下來，證明在C肌管中，ApN在存在的條件下發揮其抗炎作用：它降低TNFα（?55％）和CCL28（-28％） 同時增加IL-6 mRNA（+ 40％）。

當用針對AdipoR1，SIRT1或PGC-1α的siRNA轉染肌管時，這些變化被消除。因此，AdipoR1-SIRT1-PGC-1α信號通路的每個組分似乎是ApN在C和營養不良肌肉中的抗炎作用所必需的。

結論：

首先，與對照組相比，營養不良肌管的基礎ApN表達和分泌降低。之前的研究已經表明，在急性或慢性炎癥的環境中，ApN在體內被“正常”的小鼠骨骼肌過度產生，以局部抵消過度和有害的炎癥反應。相比之下，mdx小鼠的骨骼肌不能局部過度產生ApN。同樣，這種情況似乎在人類營養不良肌管中也有同樣的表現，與對照相比，ApN表達降低。這表明在DMD肌管中ApN的潛在缺陷，并支持在該病理學中推薦ApN補充的說法。 ApN對肌細胞分泌狀況的影響仍然很大程度上是不明確的。為了研究ApN治療前后DMD肌管的分泌物譜。使用Rybiotech的細胞因子抗體芯片進行檢測并用ELISA方法進行驗證，我們確定了幾種由人類營養不良肌管分泌的肌動蛋白是由ApN調節。這些肌肉蛋白屬于四個家族：抗炎因子/細胞因子，可溶性受體和趨化因子。ApN下調了幾種促炎癥分子（TNFα，IL-17A和CCL28），同時上調IL6，其在免疫應答中起雙重作用。據我們所知，這兩種分子（sTNFRII，CCL28）是人肌管的新型分泌產物。ApN通過AdipoR1和AMPK-SIRT1-PGC-1α途徑介導其對控制肌管的保護，從而導致轉錄因子NF-κB表達下調。總之，ApN通過激活AdipoR1和AMPKSIRT1-PGC-1α途徑在營養不良的肌肉中保持其有益的性質，從而誘導下游肌肉分泌向較少炎癥分布的轉變，同時上調utrophin A、及其下游肌肉ApN，這機制可能成為治療DMD的關鍵點，Raybiotech的抗體芯片在該機制的研究中起重要作用。