雜志名稱: ?JEM(The Journal of experimental medicine)??（IF??12.515）

文獻引用：

Yang H, Wang H, Ju Z, et al.MD-2 is required for disulfide HMGB1–dependent TLR4 signaling[J]. The Journalof experimental medicine, 2015, 212(1): 5-14.

本實驗所用產品：RayBiotech??AAH-CYT-1(23個人細胞因子抗體芯片)

??????????????????????????? AAM-CYT-1(22個小鼠細胞因子抗體芯片)

實驗樣品：細胞上清

?研究背景:

?????機體受到病原體感染或者受到損傷時，宿主先天免疫細胞可以通過模式識別受體激活炎癥反應，有效識別病原相關分子模式PAMPs和損傷相關分子模式DAMPs，來檢測和清除入侵病原體。例如機體對細菌內毒素LPS的反應是由LBP,?CD14, MD-2, TLR4來調控的，LPS被LBP捕獲后，傳遞給CD14、MD-2，然后傳遞給TLR4，LPS結合TLR4后，激活炎癥反應，釋放IL1、TNF、IFN、HMGB1等炎癥相關因子。HMGB1是一個核蛋白，胞外的HMGB1可以作為感染和損傷引起的炎癥疾病的調控者。HMGB1是氧化還原敏感性蛋白，只有部分還原的HMGB1蛋白具有激活免疫細胞分泌細胞因子的特性，而完全還原和完全氧化狀態的HMGB1蛋白沒有這個特性。但是HMGB1被分泌出來時是不同亞型混合物，免疫系統是如何利用TLR4–MD-2系統去分辨尋找特定亞型的HMGB1？MD-2的拮抗劑篩查和應用，本論文進行了深入研究。

研究思路

1?芯片樣品準備

細胞培養和處理

1)??????巰基乙酸誘導小鼠腹膜巨噬細胞

2)??????原代人巨噬細胞

3)?????收集細胞上清檢測

2?結果

2.1 disulfide?HMGB1能夠有效結合MD-2

?如下圖所示，在HMGB1的多個亞型中，只有disulfide?HMGB1能夠誘導細胞表達TNF，并且和MD-2高效結合，當加入anti-HMGB1抗體時，可以有效阻斷這種相互作用。

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2.2?HMGB1調控的炎癥反應依賴MD-2的參與

將RAW264.7細胞沉默MD-2基因，?HMGB1刺激野生型細胞和基因沉默細胞，發現TNF、NF-kb、P50、P65的表達在基因沉默細胞中都顯著下調。

RayBiotech抗體芯片檢測HMGB1刺激細胞上清，發現G-CSF, IL-12p40, IL-6, TNF,RANTES, MCP-1, sTNFR1?這7個細胞因子在基因沉默細胞上清中顯著下調。未加HMGB1刺激的細胞組作為對照，發現WT和MD-2KO細胞上清表達無明顯差異。同時可以看出，HMGB1可以刺激WT細胞的多個炎癥因子高表達。

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2.3?尋找MD-2結合的多肽，作為HMGB1的特異結合抑制劑

??????SPR和分子對接試驗都驗證FSSE(P5779)可以有效結合MD-2。

?2.4 RayBiotech抗體芯片驗證多肽抑制劑的效果

如下圖所示，HMGB1刺激小鼠巨噬細胞可以促進IL6、IL12、RANTES、MCP-1高表達，而P5779可以有效抑制這些因子高表達。

LPS刺激人原代巨噬細胞的多個炎癥因子高表達，而P5779不會抑制這些因子的高表達。這說明P5779選擇性的抑制HMGB1-MD-2-TLR4信號通路，而不會抑制巨噬細胞對PAMPs的響應。

3?結論

?????MD-2能夠特異識別HMGB1二硫化物，從而促進TLR4信號傳遞。FSSE（P5779）作為MD-2的拮抗劑，可以有效抑制HMGB1-MD-2-TLR4信號通路，而不會影響巨噬細胞對PAMPs的響應。該研究揭示了先天免疫系統可以特異識別HMGB1亞型的分子機制，且發現可以針對性衰減損傷相關分子模式DAMPs介導的炎癥反應，同時保持抗菌免疫應答。RayBiotech芯片的篩查結果為尋找關鍵的新的機制提供重要依據。