雜志名稱：Cell Death and Disease

文獻題目：Yu, Shi-Tong, et al. "CRLF1 promotes malignant phenotypes of papillary thyroid carcinoma by activating the MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways."?Cell death & disease?9.3 (2018): 371.

第一作者：Shi-Tong Yu

通訊作者：Mu-Sheng Zeng、Xiao-Ming Huang

作者單位：Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, 107 Yanjiang West Road, Guangzhou, 510120, China

本實驗所用產品：AAH-MAPK-1（人MAPK磷酸化信號通路芯片）

實驗樣品：乳頭狀甲狀腺癌組織

研究背景：

????乳頭狀甲狀腺癌（PTC）是最普遍的內分泌癌癥，是甲狀腺癌近十年中發病率最高的類型。PTC通常可被治愈，5年生存率>95%，但在某些病例中，PTC去分化且伴有侵略性。近期研究表明，遺傳學變化可通過MAPK/ERK和PI3K/AKT通路促進腫瘤增殖和轉移，導致不良預后。對不良預后患者表達的基因進行基因圖譜分析，發現細胞因子受體樣因子（CRLF1）在癌組織中有較大的變化，可作為PTC治療的潛在靶點。CRLF1是一種分泌蛋白，屬于細胞因子受體家族，雖然已有報道CRLF1能促進神經細胞生長和存活，但對其功能機制尚未明確。本文探究CRLF1在PTC中的表達和其在PTC中的主要功能與分子機制。

1 結果

1.1?生物信息學分析說明CRLF1可作為PTC的候選靶點基因

????為區分出PTC中潛在的腫瘤相關基因，生物信息軟件分析TCGA數據，發現了197個候選基因。取PTC組織通過定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)驗證，發現CRLF1 mRNA和CRLF1蛋白表達水平明顯偏高。（圖a）對不同細胞系（TPC-1、 IHH-4、 B-CPAP、8305C 、SW579、Nthy-ori 3-1）進行qRT-PCR和免疫印跡（WB），發現CRLF1 mRNA和蛋白只在B-CPAP (PTC細胞系)和 8305C (甲狀腺未分化癌) 表達（圖d）。表明CRLF1高表達于PTC，尤其是那些伴有淋巴結轉移或癌癥晚期的患者中。

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1.2?CRLF1高表達與侵略性臨床病理特征和低生存率有關

?????為了進一步研究CRLF1表達量和癌癥臨床病理特征的相關性，免疫組化分析201份PTC切片樣本。結果表明，有83個樣本（41.3%）高表達CRLF1，高表達CRLF1與腫瘤大小、甲狀腺外擴散、T期、N期和臨床期有關（表1）。將病患分為兩個組（I/II期和 III/IV期），發現高表達CRLF1的患者樣品伴有較差的疾病生存率（DFS）（圖d/e）結果說明，CRLF1表達水平與低生存率有關，CRLF1蛋白表達量對PTC有重要的預后作用。

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1.3?CRLF1促進PTC細胞增殖

??????通過對CRLF1基因進行功能獲得型（突變）和功能缺失型（突變）實驗，探究CRLF1的作用。B-CPAP細胞中CRLF1經siRNAs (si-1#和si-2#)處理后被抑制，B-CPAP細胞增殖速率和克隆形成能力低于對照組（si-NC）。將超表達的CRLF1的TPC-1細胞系（低表達CRLF1）中，發現CRLF1異常表達增強細胞增殖能力（圖f/g）。評估CRLF1對體內腫瘤生長的作用效果, CRLF1超表達的IHH-4 細胞，細胞生長更快且面積更大（圖h）。結果說明CRLF1促進腫瘤體外和體內增殖。

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1.4?CRLF1促進PTC細胞遷移和侵入并誘導上皮間質轉化

????由于CRLF1表達水平與N期和M期有關，我們進一步研究CRLF1是否影響B-CPAP 細胞遷移能力和侵入能力，結果轉染si-CRLF1-1#或 si-CRLF1-2#的細胞遷移能力明顯低于si-NC組，說明CRLF1提高PTC細胞的遷移能力和侵入能力。TPC-1和IHH-4細胞中CRLF1異常表達能促進遷移和侵入，說明CRLF1能增強PTC細胞的遷移能力和侵入能力（圖c）。實驗研究CRLF1是否影響PTC細胞的上皮間質轉化（EMT），結果鈣粘蛋白表達下調。間葉細胞標記物（波形蛋白、纖粘連蛋白）表達水平上調，證明CRLF1在PTC細胞中誘發EMT（圖f）。CRLF1敲除抑制細胞生長入侵,進一步說明CRLF1可能促進PTC細胞惡性表型。

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1.5?CRLF1通過MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路調控致瘤

? ? ? ??為了確定CRLF1在PTC細胞中影響腫瘤形成的潛在機制，使用磷酸化信號檢測芯片檢測IHH-4細胞。在CRLF1超表達的IHH-4細胞中AKT (p-S473) 和 ERK1/2 (p-T202/Y204, p-Y185/Y187)磷酸化水平升高（圖a）。WB分析，發現CRLF1可能激活JAK2和SHP2磷酸化，從而激活ERK1/2和AKT(pS473)磷酸化。在CRLF1超表達的IHH-4腫瘤細胞中p-ERK1/2和 p-AKT高表達。加入U0126 ( MEK 抑制劑) 和 MK-2206 ( AKT抑制劑)，判斷抑制劑是否可以影響IHH-4-CRLF1癌細胞的生長，結果ERK 和 AKT表達水平下調，說明CRLF1可能通過部分MAPK/ERK和 PI3K/AKT信號通路調控腫瘤形成（圖d）。

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結論：

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? ?在本文中，首先驗證了CRLF1可以增強PTC癌細胞的浸潤能力，導致不良預后，緊接著通過磷酸化信號檢測芯片，發現了CRLF1異常表達可能激活JAK2和SHP2磷酸化，接著激活MAPK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路調控腫瘤形成。本研究說明了CRLF1對癌細胞快速生長和克隆的重要作用，為進一步研究PTC有重要意義。