雜志名稱: ?Cancer Cell (IF: 23.893)

文獻題目：A Positive Feedback Loop betweenMesenchymal-like Cancer Cells and Macrophages Is Essential to Breast CancerMetastasiss

本實驗所用產品：RayBiotech人AAH-CYT-5抗體芯片

（80個炎癥、趨化?等細胞因子抗體芯片）

實驗樣品：細胞上清

研究背景:

乳腺癌是婦女死亡的主要惡性腫瘤之一，乳腺癌轉移是引起病人死亡的主要原因。目前對于乳腺癌轉移主要依靠放療和化療，但經過多個療程的化療、放療后乳腺癌仍然可能復發轉移。針對乳腺癌轉移的治療成為了提高乳腺癌生存率的重要環節。上皮—間質轉化（EMT）在惡性腫瘤轉移中的重要作用日益受到關注。為了實現轉移，癌細胞必須經歷表型轉變，通過EMT過程從貼壁依賴性細胞轉變為移動細胞。研究表明，EMT標記物表達在個體和群體水平都與乳腺癌預后不良相關。EMT過程對腫瘤的侵襲和轉移有重要的意義。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associatedmacrophages, TAMs）是浸潤在實體腫瘤中的巨噬細胞，屬于細胞間質成分。乳腺癌是巨噬細胞浸潤程度最高的惡性腫瘤之一，部分病例的巨噬細胞甚至占了腫瘤成分50%以上。近來的研究發現，腫瘤相關巨噬細胞浸潤程度與腫瘤轉移成正相關，是乳腺癌獨立的預后因素。

研究思路

1?細胞培養

分別培養上皮型乳腺癌細胞系T47D, BT-474, MCF-7，間質型乳腺癌細胞系MB-231, MB-436, BT-549，取其上清分別培養巨噬細胞，發現間質型乳腺癌細胞上清可以誘導巨噬細胞延伸和拉長，發生間質表型變化，且細胞表面標志物CD206表達增高、HLA-DR表達降低，與腫瘤相關巨噬細胞特征相似。腫瘤促進因子CCL18、CCL17、CCL22、?IL10在間質型乳腺癌細胞上清刺激的巨噬細胞中表達升高。用TGFb，TNFa刺激MCF-7細胞以及MCF-7微球體培養使其轉變為間質型細胞，用其細胞上清刺激巨噬細胞，得到同樣的結果，巨噬細胞延伸和拉長，發生間質表型變化。

2?RayBiotech芯片篩查誘導巨噬細胞表型變化的細胞因子

采用RayBiotech AAH-CYT-5的細胞因子抗體芯片篩查MCF-7細胞上清（陰性對照）、TGFb-MCF-7（間質型細胞），TNFa-MCF-7（間質型細胞）、MCF-7m（間質型細胞），MB-231(陽性對照)細胞上清的細胞因子表達差異，篩選到GM-CSF, IL-8, CCL2, GRO ,GROa?以及MCSF在間質型細胞上清中表達顯著高于陰性對照，與除了MCSF以外其他5個因子結果與ELISA驗證結果一致。后續用重組GM-CSF, IL-8, CCL2, GRO刺激巨噬細胞，證明GM-CSF可以刺激巨噬細胞發生表型變化，表現腫瘤相關巨噬細胞特征。用GM-CSF中和抗體添加到間質型乳腺癌細胞培養基后，TAMs表面標志物以及腫瘤促進因子CCL18、CCL17、CCL22、?IL10的表達都顯著降低。

3? ?GMF-CSF?與CCL18正循環的發現、機制、體內研究以及臨床應用

???? GM-CSF激活的巨噬細胞通過CCL18誘導乳腺癌細胞上皮-間質轉化，CCL18是通過激活NF-kb信號通路來促進EMT的。GM-CSF和CCL18形成正循環誘導腫瘤細胞上皮-間質轉化，且在小鼠實驗中證明這個正循促進EMT及腫瘤轉移，進一步的臨床樣品檢測也表明GM-CSF和CCL18正循環與乳腺癌患者的三陰性亞型、腫瘤轉移、預后差密切相關。

結果：??腫瘤的上皮-間質轉化與其緊密相鄰的腫瘤相關巨噬細胞密切相關，兩者之間存在相互作用。研究表明，間質型乳腺癌細胞通過GM-CSF激活巨噬細胞轉變為腫瘤相關巨噬細胞，而TAMs分泌CCL18誘導腫瘤細胞上皮-間質轉化，形成正循環。在共培養系統和人源化小鼠模型中，抑制GM-CSF或者CCL18都可以抑制腫瘤的轉移。乳腺癌樣品的高表達GM-CSF會引起巨噬細胞CCL18的高表達，腫瘤上皮-間充質轉化，腫瘤轉移，從而降低病人的生存率。芯片在本論文起到非常關鍵及不可替代的作用。